Snelle testen op enzymen

Het aantonen van bepaalde enzymen
Eigenlijk een wat rare indeling, want alle biochemische reacties worden door enzymen veroorzaakt, maar omdat deze enzymen wat moeilijk zijn in te delen deze aparte groep. Wel hebben onderstaande reacties gemeen dat ze heel snel bepaald kunnen worden.

Katalase
Micro-organismen die in staat zijn tot een aerobe ademhaling bezitten het enzym katalase, dat waterstofperoxide splitst in water en zuurstof:

2 H2O2 -----------> 2 H2O + 2 O2

Waterstofperoxide ontstaat tijdens de aërobe ademhaling, het is giftig. Katalase voorkomt dus afsterving van de bacteriecel door het peroxide af te breken.

Het bezit van katalase is heel snel vast te stellen door waterstofperoxide in contact te brengen met koloniemateriaal. Bij een positieve reactie ontstaan er direct na toevoeging belletjes, bij een negatieve reactie ontstaan geen belletjes of pas na 30-40 seconden zeer zwak bruisen ( door het enzym peroxidase). Alle melkzuurbacteriën zijn katalasenegatief en zo te onderscheiden van andere grampositieve coccen en staven.
Een bijzondere plaats nemen de anaërobe Propionzuurbacteriën in, deze hebben een anaerobe stofwisseling maar zijn wel katalasepositief.

Oxidase
Er is een eenvoudige snelle en goedkope test om de strikt aerobe micro-organismen zoals bijvoorbeeld Pseudomonas te onderscheiden van de facultatief anaerobe micro-organismen zoals de Enterobacteriën. Dit is de oxydasetest. Met deze test wordt een ademhalingsenzym aangetoond dat in strikt aërobe micro-organismen in zo'n hoge concentratie aanwezig is dat het zeer snel aantoonbaar is. De bepaling zelf is zeer eenvoudig: je brengt wat koloniemateriaal op een papiertje waarin zich stoffen ( N,N-dimethyl-p-phenyleendiamine en ALFA-naphtol) bevinden die in aanwezigheid van het oxydase direct donkerpaars kleuren. Is deze test positief dan weet je dat je niet met een enterobacterie te maken heeft.

Coagulase
Coagulase is een exo-enzym dat fibrinogeen in bloedplasma kan omzetten in fibrine hetgeen met het oog op een objectglas zichtbaar is.Dit enzym is kenmerkend voor de pathogene Staphylococcus aureus.

ß-galactosidase
Voor de afbraak van lactose zijn als eerste twee enzymen nodig, het eerste is een lactosepermease, het tweede is het enzym dat het lactose (een disaccharide) splitst in de bouwstenen glucose en galactose. Dit enzym heet ß-galactosidase. Er zijn stammen die beide enzymen zeer snel (binnen 24 uur)vormen en dus lactose-positief zijn. Niet-lactose vergisters missen beide enzymen. Een derde groep bezit wel ß-galactosidase maar geen lactosepermease (of een zeer traag werken permease). Om toch te weten te komen of een micro-organisme het enzym ß-galactosidase bezit is er de ONPG test. Het ONPG of orthonitrofenylgalactoside ( dit woord hoef je niet te leren!) past ook op het enzym en kan dus ook als substraat dienen. Het dringt gemakkelijk de cel binnen en als het door ß-galactosidase wordt gesplitst ontstaat een felgele kleurstof. Dit gebeurt al binnen enkele uren. Een dergelijk substraat wordt een chromogeen substraat genoemd. Deze worden ook in selectieve voedingsbodems gebruikt, de chromogene media, zodat op de telplaat al een determinatie mogelijk. Er zijn ook fluorogene substraten die in ophopingsmedia gebruikt worden.